La Sélectivité en Chromatographie

Un Guide Souple Pour les Débutants

Salut à toi, futur expert en chromatographie et validation analytique ! Si tu débutes dans ce monde fascinant des pics, des colonnes et des détecteurs, ne t’inquiète pas, on va t’expliquer un concept super important : la sélectivité. Et pas de panique, on va garder ça cool et simple, tout en restant précis. Alors, accroche-toi, c’est parti !

Traitement des chromatogrammes en validation

C’est quoi la sélectivité, en vrai ?

Imagine que tu es dans une foule et que tu cherches ton ami Omar. Sauf que Omar porte le même t-shirt que 10 autres personnes. Pas facile, hein ? Maintenant, imagine que Omar porte un chapeau rouge fluo. Là, tu le repères direct ! Eh bien, en chromatographie, la sélectivité, c’est un peu ça : c’est la capacité de ta méthode à repérer ton composé d’intérêt (ton Omar) sans te faire avoir par les autres composés (les faux Omar en t-shirt similaire).

En termes techniques, la sélectivité, c’est la capacité d’une méthode analytique à distinguer clairement l’analyte (ce que tu veux mesurer) des autres substances qui pourraient traîner dans ton échantillon, comme des impuretés, des produits de dégradation ou des excipients. Si ta méthode est sélective, tu peux dormir sur tes deux oreilles : tes résultats seront fiables.

Comment on vérifie la sélectivité ?

Pour s’assurer que ta méthode est bien sélective, il y a un petit protocole à suivre. On appelle ça l’essai de conformité du système (sélectivité). Voici comment ça se passe :

1. Injection des substances pures : Tu injectes ton analyte pur et les autres substances qui pourraient interférer (impuretés, excipients, etc.) séparément. Comme ça, tu vois où chacun se situe sur ton chromatogramme (c’est un peu comme leur carte d’identité chromatographique).
2. Injection d’un mélange : Ensuite, tu mélanges tout ce petit monde et tu injectes le mélange. Là, tu vérifies que les pics de ton analyte et des autres composés sont bien séparés. Si les pics se chevauchent, c’est mauvais signe : ta méthode n’est pas assez sélective.
3. Analyse des résultats : Tu dois t’assurer que les pics sont bien résolus. En général, on vise une résolution ≥ 1,5 entre les pics. Si c’est bon, tu peux dire que ta méthode est sélective. Sinon, retour à la case départ pour optimiser ta méthode !

Et l’EDQM dans tout ça ?

L’EDQM (European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare), c’est un peu le gardien de la qualité des médicaments en Europe. Ils ont récemment publié une nouvelle FAQ pour clarifier un point important sur la sélectivité dans les monographies de la Pharmacopée Européenne (Ph. Eur.). Voici ce qu’il faut retenir :

Nouvelle FAQ de l’EDQM : La sélectivité sous DOSAGE

Dans beaucoup de monographies, quand tu fais un dosage par chromatographie (HPLC, CPG, etc.), on te renvoie à la procédure décrite dans la section ESSAI pour vérifier la pureté. Sauf que parfois, c’est un peu flou. Du coup, l’EDQM a décidé de simplifier les choses à partir de la 13e édition (à partir de janvier 2027). Voici les nouveautés :

1. Clarté renforcée : Les monographies vont maintenant indiquer clairement sous la section DOSAGE :
• Le nom de la solution témoin à injecter pour vérifier la sélectivité.
• Les critères de sélectivité à respecter (comme la résolution ou le rapport pic/vallée).
2. Justification de l’absence de sélectivité : Si l’essai de sélectivité n’est pas nécessaire (parce que ta substance est super pure ou que ta méthode est ultra-sélective), il faudra le justifier. Pas de sélectivité ? Pas de problème, mais il faut expliquer pourquoi.

Pourquoi c’est important ?

La sélectivité, c’est un peu la base de la validation analytique. Si ta méthode n’est pas sélective, tu risques de mesurer n’importe quoi, et ça, c’est pas cool. Imagine donner un médicament dont la pureté n’est pas bien vérifiée… Pas top pour la santé publique !

Avec les nouvelles directives de l’EDQM, tout devient plus clair. Plus besoin de se casser la tête à chercher les infos dans tous les coins des monographies. Tout sera bien expliqué sous la section DOSAGE. Et si la sélectivité n’est pas nécessaire, tu sauras pourquoi .

En résumé : La sélectivité, c’est la clé !

• Sélectivité = capacité à distinguer ton analyte des autres composés.
• Essai de conformité du système = vérification que les pics sont bien séparés.
• Nouvelle FAQ de l’EDQM = plus de clarté sur les critères de sélectivité dans les monographies.

Ah, je voie venir ta question, tu veux savoir comment optimiser ta méthode chromatographique quand les pics ne sont pas bien résolus ? Pas de souci, je vais te guider à travers les étapes clés suivantes pour améliorer la séparation et atteindre cette fameuse résolution ≥ 1,5.

Optimisation d’une Méthode Chromatographique : Le Guide Ultime pour des Pics Bien Résolus

Optimiser une méthode chromatographique, c’est un peu comme résoudre un puzzle : il faut ajuster les bonnes pièces pour que tout s’emboîte parfaitement.

Nous allons voir ensemble comment jouer avec ces pièces comme (la phase mobile, la colonne, la température) jusqu’à obtenir le bon tableau. Avec un peu de patience et en suivant ces étapes, tu vas réussir à atteindre une résolution ≥ 1,5 et à rendre ta méthode sélective et fiable. Alors, à toi de jouer !

1. Comprendre la résolution (R)

La résolution (R), c’est la mesure de la séparation entre deux pics adjacents sur ton chromatogramme. Elle se calcule avec la formule suivante :

Formule de calcule de la résolution

Où :

• Tr1 et Tr2 : Sont les temps de rétention des deux pics.
• W1 et w2 : ​Sont les largeurs des pics à la base.

Si R  ≥ 1,5 :  Les pics sont bien séparés.

Si R < 1,5 : C’est le moment d’optimiser.

2. Les paramètres à optimiser

Pour améliorer la résolution, tu peux jouer sur plusieurs paramètres. Voici les principaux :

A. La phase mobile

• Composition du solvant : Modifie le ratio des solvants (par exemple, eau/méthanol ou eau/acétonitrile) pour ajuster la polarité. Parfois, un petit changement peut faire une grande différence.
• pH de la phase mobile : Si tes composés sont ionisables, ajuster le pH peut améliorer la séparation. Utilise des tampons pour stabiliser le pH.
• Débit : Réduire le débit peut améliorer la résolution, mais ça augmente le temps d’analyse. Trouve un bon compromis.

B. La phase stationnaire (la colonne)

• Type de colonne : Choisis une colonne avec une chimie de phase stationnaire adaptée à tes composés (par exemple, C18, C8, phényl, etc.).
• Longueur de la colonne : Une colonne plus longue peut améliorer la résolution, mais attention au temps d’analyse.
• Taille des particules : Des particules plus petites (par exemple, 3 µm au lieu de 5 µm) augmentent l’efficacité de la colonne, mais aussi la pression.

C. La température

• Température de la colonne : Augmenter la température peut réduire la viscosité de la phase mobile et améliorer la séparation. Mais attention, ça peut aussi affecter la stabilité des composés.

D. Le gradient

• Gradient d’élution : Si tu utilises un gradient (changement de la composition de la phase mobile pendant l’analyse), ajuste les pentes et les temps pour mieux séparer les pics.

3. Stratégies d’optimisation

Voici comment tu peux t’y prendre pour optimiser ta méthode :

Étape 1 : Identifier le problème

• Regarde ton chromatogramme : les pics sont-ils trop proches ? Trop larges ? Asymétriques ?
• Mesure la résolution entre les pics problématiques.

Étape 2 : Ajuster la phase mobile

• Commence par modifier légèrement la composition des solvants (par exemple, 60/40 eau/méthanol au lieu de 50/50).
• Si tes composés sont sensibles au pH, teste des tampons à différents pH (par exemple, pH 3, 5 ou 7).

Étape 3 : Changer la colonne

• Si la phase mobile ne suffit pas, essaie une colonne différente. Par exemple, passe d’une C18 à une C8 ou une colonne phényl.
• Vérifie aussi la longueur et la taille des particules de la colonne.

Étape 4 : Jouer avec la température

• Augmente ou diminue la température de la colonne par paliers de 5 °C et observe l’effet sur la résolution.

Étape 5 : Optimiser le gradient

• Si tu utilises un gradient, ajuste les temps et les pentes pour mieux séparer les pics. Par exemple, ralentis le gradient autour des temps de rétention critiques.

Étape 6 : Valider les modifications

• Après chaque changement, injecte ton mélange et recalcule la résolution. Continue jusqu’à atteindre Rs  ≥ 1,5

4. Astuces supplémentaires

• Utilise des logiciels d’optimisation : Certains logiciels (comme DryLab ou ChromSword) peuvent t’aider à simuler les effets des changements de paramètres sans faire des centaines d’injections.
• Fais des essais en mode isocratique : Si tu utilises un gradient, essaie d’abord en isocratique (phase mobile constante) pour comprendre comment tes composés se comportent.
• Vérifie l’asymétrie des pics : Si tes pics sont asymétriques (frontés ou traînés), ça peut nuire à la résolution. Ajuste le pH ou change de colonne.

5. Exemple concret

Imagine que tu as deux pics avec une résolution de 1,16. Voici ce que tu pourrais faire :

1. Modifier la phase mobile : Passe de 50/50 eau/méthanol à 55/45.
2. Changer la colonne : Utilise une colonne C8 au lieu d’une C18.
3. Ajuster le pH : Si tes composés sont acides, teste un tampon à pH 3.
4. Augmenter la température : Monte de 25 °C à 30 °C.
5. Vérifier la résolution : Si elle passe à 1,8, c’est gagné !

Chromatogramme avec R = 1.47

Chromatogramme avec R = 1.7

En conclusion : La Sélectivité, C’est sacré !

Voilà, tu l’auras compris, la sélectivité en chromatographie, c’est un peu comme un détecteur de mensonges ultra-performant : elle te permet de savoir avec certitude que tu analyses bien la bonne molécule, sans être perturbé par des intrus. Une méthode bien sélective, c’est l’assurance de résultats fiables, reproductibles et acceptables pour les autorités réglementaires.

Avec la clarification des monographies de l’EDQM, tout devient plus simple, et tu sais maintenant exactement où chercher les infos pour valider ta méthode. Et si jamais tu galères avec des pics récalcitrants, souviens-toi des astuces d’optimisation : composition de la phase mobile, type de colonne, pH, température… Bref, joue avec les paramètres, expérimente, et trouve la recette parfaite pour une séparation aux petits oignons.

Note de l’Auteur

Voilà, si tu es arrivé jusqu’ici, c’est que tu es vraiment déterminé à devenir un as de la chromatographie. Et ça, c’est trop cool ! Alors, laisse-moi te dire un truc : optimiser une méthode chromatographique, c’est un peu comme cuisiner une recette secrète. Parfois, il faut ajouter un peu plus de ceci, un peu moins de cela, et tester, tester, encore tester… jusqu’à ce que tout soit parfait. Et quand tu y arrives, c’est une vraie victoire !

N’oublie pas : la chromatographie, c’est une science, mais c’est aussi un art. Il faut de la patience, de la curiosité, et surtout, ne pas avoir peur de se tromper. Parce que chaque erreur, c’est une leçon qui te rapproche un peu plus de la méthode parfaite. Alors, prends ton temps, expérimente, et surtout, amuse-toi ! Oui, oui, amuse-toi ! Parce que même si c’est technique, c’est aussi hyper passionnant de voir comment tes petits ajustements peuvent transformer un chromatogramme chaotique en une œuvre d’art bien résolue.

Et si un jour tu te sens un peu perdu (ça arrive à tout le monde, même aux experts), reviens à ce guide. Il est là pour te rappeler les bases et te donner des astuces pour t’en sortir. Parce que dans le monde de la chromatographie, on est une grande famille, et on s’entraide !

Alors, continue comme ça, futur expert. Tu vas y arriver, et quand ce sera le cas, tu pourras te retourner et dire : « J’ai réussi à séparer ces satanés pics ! » Et ça, c’est une fierté que personne ne pourra t’enlever.

Reda LOURGUIOUI

FAQ

Q1 : Pourquoi viser une résolution ≥ 1,5 ?

• Réponse : Une résolution ≥ 1,5 garantit que les pics sont bien séparés, ce qui permet une quantification précise sans interférence. En dessous, les pics peuvent se chevaucher, faussant les résultats.

Q2 : Que faire si mes pics sont trop larges ?

• Réponse : Des pics larges peuvent indiquer une mauvaise efficacité de la colonne. Essaie de réduire la taille des particules de la colonne ou d’augmenter légèrement le débit.

Q3 : Comment choisir la bonne colonne ?

• Réponse : Tout dépend de tes composés. Pour des molécules polaires, une colonne C18 peut ne pas être idéale. Une colonne phényl ou C8 pourrait mieux convenir. N’hésite pas à tester plusieurs options.

Q4 : Le pH influence-t-il vraiment la séparation ?

• Réponse : Oui, surtout si tes composés sont ionisables. Un pH mal adapté peut causer des pics asymétriques ou une mauvaise résolution. Utilise des tampons pour stabiliser le pH.

Q5 : Puis-je utiliser un gradient dès le début ?

• Réponse : Pas forcément. Commence en mode isocratique pour comprendre le comportement de tes composés. Ensuite, passe au gradient si nécessaire pour améliorer la séparation.

Q6 : Combien de temps faut-il pour optimiser une méthode ?

• Réponse : Ça dépend de la complexité du mélange et de ton expérience. Avec une bonne stratégie, ça peut prendre quelques heures à quelques jours. Les logiciels d’optimisation peuvent accélérer le processus.

Q7 : Quel est le temps idéal à rechercher pour mes pics ?

• Réponse : Le temps de rétention idéal dépend de ton analyse, mais en général, on vise des pics entre 2 et 10 minutes pour une analyse efficace. Voici quelques conseils :
• Trop tôt (moins de 2 minutes) : Les pics peuvent être mal résolus ou interférer avec le pic du solvant (pic de l’injection).
• Trop tard (plus de 10 minutes) : L’analyse devient longue, et les pics peuvent s’élargir, réduisant la résolution.
• Astuce : Si tes pics sont trop proches du début, augmente la polarité de la phase mobile (plus d’eau). S’ils sont trop tardifs, réduis la polarité (plus de solvant organique).